外泌體凍干粉制備指南

一、外泌體凍干粉基礎認知

1.什么是外泌體凍干粉？

定義：外泌體是細胞分泌的納米級囊泡（直徑30-150nm），攜帶蛋白質、RNA等活性物質，具有修復、抗炎、抗衰功能。凍干粉通過低溫冷凍干燥技術保存外泌體活性，需與溶媒混合后使用。

2.       核心優勢

（1）高效滲透：穿透皮膚屏障直達肌底，促進膠原蛋白再生。

（2）低免疫原性：來源于干細胞（如臍帶間充質干細胞），安全性高。

（3）多功能性：適用于抗衰、修復、毛發再生等場景。

3.應用領域

（1） 醫美與護膚：抗衰精華、術后修復、疤痕治療。

（2）再生醫學：毛發再生、神經損傷修復等。

（3） 新興賽道：霧化式可吸入外泌體，開辟“呼吸抗衰"藍海市場。

三、外泌體凍干粉的完整工藝流程

整個流程可以分為三大階段：凍干前準備、冷凍干燥過程、凍干后處理。

（一）凍干前準備（預處理）

1.1 外泌體樣本預處理：

置換緩沖液/透析：這是至關重要的一步。外泌體通常懸浮在PBS或細胞培養上清中，這些溶液中的鹽分（如NaCl）在冷凍和干燥過程中會形成結晶和“液橋"，產生巨大的機械應力和滲透壓，導致外泌體膜破裂。必須將緩沖液置換為凍干保護劑溶液。

濃縮：確保凍干前樣本有足夠高的濃度，以獲得理想的凍干粉復溶效果和得率。

1.2 凍干保護劑的添加與混合

（1）目的：在冷凍和干燥過程中保護外泌體結構，形成無定形的玻璃態，防止冰晶和溶質結晶的破壞。

（2）常用保護劑配方（需要客戶優化）：

基礎糖類： 海藻糖（首先選擇，玻璃化轉變溫度高，化學惰性）、蔗糖、甘露醇。濃度通常在5%-15%（w/v）。

蛋白類： 人血清白蛋白（HSA）或牛血清白蛋白（BSA），可以提供額外的保護，但需注意引入外源蛋白。

聚合物： 葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）。

混合： 必須確保保護劑與外泌體懸液充分、溫和地混勻，避免產生氣泡和剪切力。

（二）冷凍干燥過程

2.1.分裝

將混合好的樣品分裝到西林瓶或凍干瓶中。建議使用低蛋白吸附的凍干瓶，并控制裝液厚度，通常不超過1-1.5cm，以保證干燥效率一致。

2.2 預凍

（1）目的：將樣品全部凍結，形成有利于升華的冰晶結構。

（2）方法：

程序降溫法（推薦）： 使用凍干機的程序降溫功能，以可控速率（例如-1℃/min）緩慢降溫至至少-40℃~-50℃，并在此溫度下保溫4小時以上。這有助于形成大小均一的冰晶，減少對外泌體的損傷。

快速凍結法： 直接將樣品放入超低溫冰箱（-80℃）或液氮中。此法冰晶細小，但可能導致部分樣品熱應力。

（3）       關鍵：確保樣品全部凍實。

2.3一次干燥（主干燥/升華干燥）

（1）原理：在真空下，使冰直接升華為水蒸氣。

（2）參數設置：

真空度：通常設置在10-100 Pa（0.1-1.0 mbar） 范圍內。精確的真空度需要根據產品的共晶點溫度來確定。

隔板溫度：緩慢升溫。起始溫度可設為-40℃至-30℃，然后以非常緩慢的速率（如0.1℃/min）升高，最高不要超過0℃。升溫過快會導致樣品塌陷、融化或起泡。

（3）終點判斷：一次干燥的終點非常重要。可以通過以下方式判斷：

壓力升高法（PRT）：短暫關閉凍干箱和冷阱之間的閥門，觀察箱內壓力在特定時間（如30秒）內的上升速率。當速率低于某個閾值（如1-2 Pa/30s）時，表明絕大部分冰已升華完畢。

樣品溫度趨近于隔板溫度。

2.4 二次干燥（解吸干燥）

（1）原理： 去除通過氫鍵等作用力吸附在物料上的結合水。

（2）參數設置：

隔板溫度： 緩慢升至一個較高的溫度，如 +20℃至+30℃。對于敏感的外泌體，建議從低溫度開始摸索（如20℃）。

真空度：維持在一次干燥時的真空度或更低。

時間：通常需要4-10小時，具體時間取決于樣品量和殘留水分要求。

（三）       凍干后處理

1.充氮/惰性氣體破空：干燥結束后，在出箱前向凍干箱內充入干燥、無菌的氮氣或氬氣，以替代空氣。這一步是為了防止空氣中的水分和氧氣影響產品穩定性。

2.壓塞與密封：如果使用西林瓶，在真空或氮氣環境下進行壓塞。然后迅速用鋁蓋密封。

3.儲存：建議在-20℃或-80℃ 下避光長期儲存。凍干粉在室溫下短期穩定，但長期穩定性需驗證。